• Got Patrice

Méthode de cytométrie en flux

Principe

Le cytomètre en flux est un appareil permettant la quantification et la qualification individuelle de cellules en fonction de leur taille, de leur fluorescence (liée aux pigments naturels ou aux marqueurs fluorochromiques) en réponse à une stimulation lumineuse ( laser de 488 nm pour le Facscalibur).

Le cytomètre en flux détecte la capacité d’une cellule à diffracter la lumière incidente et à émettre une fluorescence.

L’échantillon entre sous pression dans la chambre d’analyse, entouré par un liquide de gaine de même salinité. Les cellules s’alignent dans le liquide de gaine pour passer une par une devant la source lumineuse (laser).

Les cellules sont caractérisées par leur taille, leur structure interne, et leur fluorescence (naturelle ou induite) grâce à différents photomultiplicateurs (FL1, FL2, FL3, FSC, SSC ) qui enregistrent simultanément toutes ces caractéristiques des cellules nécessaires à l’analyse.

D’une part, tous microorganismes autotrophes possèdent de la chlorophylle (pigment naturel), qui, sous l’excitation du laser, émet une fluorescence rouge quantifiée par le capteur FL3 (λ= 650 nm). Les cyanobactéries (procaryotes autotrophes) sont caractérisées par leurs pigments accessoires (phycobilines) qui émettent une fluorescence orange quantifiée sur le capteur FL2 (λ= 585 nm).

D’autre part, pour la quantification des microorganismes hétérotrophes comme les bactéries qui ne possèdent pas de fluorescence naturelle, on  utilise des marqueurs fluorochromiques. Le Sybergreen I (détecté sur le capteur FL1 ; λ= 530 nm) est utilisé pour les bactéries, c’est un marqueur de l’ADN et de l’ARN. Il est susceptible de marquer toutes les cellules présentes.

Enfin, la taille relative des cellules est déterminée grâce à la lumière diffractée aux petits angles (entre 1 et 10°), elle est détectée sur une diode le Forward scatter (FSC pas très précise). La lumière diffractée aux grands angles ( 90°) est proportionnelle à la granularité de la cellule et à son diamètre, elle est détectée sur un photomultiplicateur Side scatter (SSC).

Les capteurs SSC, FL1, FL2 et FL3 sont des photomultiplicateurs, ils convertissent un signal lumineux très faible en un signal électronique et le multiplie.

Le capteur FSC est une photodiode, elle convertit le signal lumineux en un courant électrique proportionnel.

Appareil

L’appareil utilisé au laboratoire est un FACSCalibur (Becton Dickinson).La source lumineuse est un laser émettant une lumière de 488 nm. Le logiciel d’acquisition et d’analyse est CellQuest Pro.

Avant l’acquisition d’un échantillon, le cytomètre doit être paramétré en fonction du type de cellule recherché. Pour les différents cytogrammes d’acquisition, on choisi les axes d’abscisse et d’ordonnée (SSC, FSC, FL1, FL2, FL3). On détermine la sensibilité du capteur correspondant aux populations recherchées, c’est à dire le seuil minimum de fluorescence à partir duquel un évènement (e.g cellule) est comptabilisé. Ce seuil permet de ne pas tenir compte de bruits électronique et des débris organiques. Pour le calibrage de taille on ajoute à l’échantillon des standards internes qui sont constitués d’un mélange de billes calibrées (1, 2, 10 et 20 µm, PolyScience) et de billes  TruCount  (TC ; solution de concentration connue) de sorte qu’elles apparaissent dans la fenêtre d’acquisition. Le liquide de gaine doit être à la même salinité que l’échantillon analysé (eau distillée + NaCl) et passé sur une cartouche  filtrante 0,2µ pour éviter de générer du bruit de fond au cours de l’analyse.

Préparation des échantillons

Les échantillons d’eau prélevés sont fixés au formaldéhyde à raison de 1% de la concentration finale de l’échantillon, puis ils sont congelés dans de l’azote liquide (-196°C) et conservés dans un congélateur basse température -80°C.

Pour l’analyse des bactéries hétérotrophes, un marqueur fluorochromique, le Sybergreen I, est ajouté : 8µl de Sybergreen I (solution stock diluée au 1/10^e) dans 300µl d’échantillon décongelé, puis les échantillons marqués sont mis à incuber à l’obscurité et au réfrigérateur pendant 10 minutes. Au moment de l’analyse, des standards internes (billes) sont rajoutés à l’échantillon, pour, d’une part, connaître la taille relative des cellules étudiées  (billes calibrées 1 et 2µm), et d’autre part, afin de calculer le volume d’échantillon (billes TruCount de concentration connue).

Pour l’analyse du nanophytoplancton, aucun marquage n’est nécessaire puisque c’est la chlorophylle qui permet de détecter les cellules. Des billes de calibration de taille de 2, 10 et 20 µm sont utilisées ainsi que des TruCount  pour déterminer le volume analysé. Le picophytoplancton (FL3 et FL2) est analysé selon la même préparation mais avec des billes de 1 et 2 µm.

Protocoles d’analyse des échantillons

La vitesse et le temps de passage sont proportionnels aux quantités de cellules supposées dans l’échantillon : les bactéries sont généralement plus abondantes que le phytoplancton. Par conséquent, la vitesse minimale (12 à 15 µl.min^-1) est utilisée pour l’analyse des bactéries hétérotrophes et la vitesse maximale (60 à 80 µl.min^-1) pour celle du nanophytoplancton et du picophytoplancton.

Pour les bactéries, il est possible de faire varier les volumes x et y d’échantillon et d’eau salée et le temps de passage en fonction de l’abondance bactérienne. En effet, on cherche à analyser au moins 10000 cellules bactériennes pour des études statistiques fiables .

De plus, pour une analyse correcte, les cellules doivent passer une par une devant le laser. Par conséquent, il faut faire attention au nombre d’évènements analysés sec^-1 analysé par le cytomètre. Si ce nombre est trop important, cela suppose que les cellules ne sont pas passées une par une et donc l’analyse sous-estime l’abondance cellulaire. Dans la mesure du possible, on essaie de ne pas dépasser 1000 évènements sec^-1 ; généralement entre 100 et 800 cellules sec^-1 pour les bactéries hétérotrophes et entre 10 et 300 cellules sec^-1 pour le phytoplancton.

L’analyse d’échantillons d’eau de la lagune de Thau permet d’obtenir des cytogrammes (Figure 1) montrant les populations de microorganismes étudiés.

A    B

CD

Figure 1 : A : Cytogramme FL3 en fonction de SSC montrant une population de nanophytoplancton (en mauve). B : Cytogramme FL1 en fonction de SSC montrant deux populations de bactéries (en bleu et vert). C : Cytogramme FL3 en fonction de SSC montrant deux populations de picophytoplancton, en orange pour le picophytoplancton de taille comprise entre 0,5 et 1,5 µm et en bleu pour le picophytoplancton de 2 µm. Les unités des axes sont arbitraires. Les autres points entourés représentent le positionnement des billes (1, 2, 10, 20µm et TruCount).

Une salle climatisée située au centre du plateau microbex  comportant 8m linéaires de paillasse, comprenant tout l’équipement nécessaire à la réalisation des analyses en cytométrie :

o     Cytomètre Facscalibur BD laser 488nm 4 PMT 1 Diode

o     Congélateur -20 et -80 °C

o     Set de micropipettes Eppendorf électroniques et manuelles

o     Vortex Genie® 2

o     Agitateurs magnétiques

o     Balance Sartorius

o     Cuve à ultrasons

Protocols of  FCM analysis of bacteria and phytoplancton :

Abundances of bacteria and phytoplancton was performed with a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson) equipped with an air-cooled argon laser (488 nm). The samples are fixed in 2% formaldehyde and stored in liquid nitrogen.

The liquid sheat fluid used have the same salinity than the sample analysed and was filtered through 0.2-µm-pore-size membrane..

 For counting bacteria, nucleic acids were stained for 15 min in the dark at 4°C with SYBR green I (Molecular Probes,Eugene, OR) (1:400, vol/vol). As an internal standard for the normalization of bacteria fluorescence emission, 1-µm and 2-µm yellow-green fluorescent cytometry beads(Polysciences, Inc.) were added to the samples. True Count beads (BectonDickinson Biosciences) were also added to the samples to determine the total cell concentration of each sample analyzed.

Acquisition data were run at low speed (around 18 µl/min), during 2 min to be sure that more than 10 000 cells are counted. Fluorescence of SYBR green-stained bacteria was collected in the green fluorescence channel FL1 (530 nm) and Side scattered light was used as a proxy of cell size. Both parameters were collected on a logarithmic scale.

For pico-phytoplancton and nano-phytoplancton the analyse was based on the red fluorescence channel FL3 (650nm) to detect the chlorophyl pigment, yellow-green fluorescent cytometry beads 1-2µm (for pico) or 2-6-10- 20-µm (for nano) and True Count beads are added as an internal standard. The same protocol was used for counting cyano-bacteria but with the orange fluorescence channel FL2 (585nm). Acquisition data were run at high speed (around 60 µl/min), during 3 min  for pico and cyano, and during 5min for nanoplancton.